流式細胞儀校準(zhǔn)規(guī)范

機械智探

　　流式細胞儀的校準(zhǔn)規(guī)范是確保實驗結(jié)果準(zhǔn)確性的重要步驟，其規(guī)范通常涵蓋多個方面，以下是對流式細胞儀校準(zhǔn)規(guī)范的詳細歸納：
　　一、校準(zhǔn)適用范圍
　　基于熒光檢測原理的分析型流式細胞儀的校準(zhǔn)應(yīng)參考相關(guān)規(guī)范執(zhí)行，其他類型的流式細胞儀可參照執(zhí)行。
　　二、校準(zhǔn)條件
　　環(huán)境溫度：應(yīng)控制在（15~30）℃。
　　相對濕度：室內(nèi)相對濕度應(yīng)≤70%。
　　三、校準(zhǔn)設(shè)備
　　校準(zhǔn)設(shè)備需經(jīng)檢定合格，且應(yīng)包括以下標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和化學(xué)試劑：
　　標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)
　　單一熒光強度的熒光微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：用于分辨力校準(zhǔn)。
　　多重?zé)晒鈴姸然旌蠠晒馕⑶驑?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：用于線性相關(guān)系數(shù)校準(zhǔn)。
　　計數(shù)熒光微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
　　淋巴細胞計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：用于重復(fù)性+示值誤差校準(zhǔn)。校準(zhǔn)時應(yīng)采用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，相對擴展不確定度不超過20%（k=2）。
　　化學(xué)試劑
　　去離子水：電阻率為18.2MΩ·cm，且需經(jīng)0.22μm濾膜過濾。
　　磷酸鈉緩沖液：0.1mol/L，pH值控制在7.2~7.4范圍內(nèi)。
　　移液器：量程為（200~1000）μL，且需達到B級及以上標(biāo)準(zhǔn)。
　　四、校準(zhǔn)項目與方法
　　外觀檢查：采用目測、手動法進行檢查。
　　分辨力校準(zhǔn)
　　儀器預(yù)熱至正常工作狀態(tài)。
　　在裝有0.5mL經(jīng)0.22μm濾膜過濾的磷酸鹽緩沖液的試管中，加入0.5mL單一熒光強度的熒光微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，混勻后上機實驗。
　　記錄前向角散射光和488nm激發(fā)下兩個熒光通道（綠色熒光FITC、橙紅色熒光PE）的信號。
　　收集門內(nèi)有效信號10000個，計算前向角散射光和兩個熒光通道中校準(zhǔn)微球峰寬的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，即為分辨力。
　　線性相關(guān)系數(shù)校準(zhǔn)
　　在裝有1mL經(jīng)0.22μm濾膜過濾的磷酸鹽緩沖液的試管中，加入20μL多重?zé)晒鈴姸然旌蠠晒馕⑶驑?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，混勻后上機實驗。
　　記錄488nm激發(fā)下綠色熒光（FITC）、橙紅色熒光（PE）通道信號。
　　對試驗結(jié)果進行直方圖分析，得到每個峰的平均熒光強度。
　　根據(jù)校準(zhǔn)微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書提供的各個峰的等量可溶性熒光分子（MESF），將各峰的MESF取對數(shù)lg(MESF)，簡化表示為y；各峰測量的平均熒光強度取對數(shù)lg(FITC)或lg(PE)，簡化表示為x。將兩者線性回歸得到方程y=kx+b，計算兩個通道的線性相關(guān)系數(shù)（r）。
　　檢出限校準(zhǔn)
　　針對綠色熒光（FITC）和橙紅色熒光（PE）熒光通道，采用線性相關(guān)系數(shù)校準(zhǔn)中得到的線性回歸方程y=kx+b。
　　計算無熒光標(biāo)記的空白微球的平均熒光強度值對應(yīng)的MESF，即為熒光檢出限（LOD）。
　　漂移校準(zhǔn)
　　將周圍環(huán)境溫度控制在允許范圍內(nèi)（設(shè)定溫度±3℃）。
　　在裝有1mL經(jīng)0.22μm濾膜過濾的磷酸鹽緩沖液的試管中，加入數(shù)滴單色熒光微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，混勻后上機試驗。
　　記錄前向角散射光和488nm激發(fā)下綠色熒光（FITC）、橙紅色熒光（PE）通道的信號，收集10000個以上門內(nèi)有效信號。
　　測試完成后，利用直方圖分析試驗結(jié)果，計算標(biāo)準(zhǔn)微球的平均熒光強度值。
　　連續(xù)開機2小時后，在相同流式細胞儀設(shè)置和熒光通道電壓值的條件下重復(fù)前述試驗步驟，得到新的平均熒光強度值。
　　計算相對漂移率來表示穩(wěn)定性。
　　重復(fù)性校準(zhǔn)
　　取100μL淋巴細胞標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按比例添加抗原決定簇CD4抗體，輕柔渦旋充分混勻后避光存放半小時，使CD4抗體與細胞充分結(jié)合。
　　標(biāo)記好CD4抗體后上機測試，收集10000個以上門內(nèi)有效信號。
　　重復(fù)測量6次，依次記錄每次測量的CD4陽性細胞占總淋巴細胞的百分比。
　　計算CD4陽性細胞數(shù)量占總淋巴細胞的百分比的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），作為重復(fù)性的評價。
　　示值誤差校準(zhǔn)
　　按照重復(fù)性校準(zhǔn)實驗中得到的CD4陽性細胞占總淋巴細胞的百分比計算平均值。
　　然后計算示值誤差，最后評估示值誤差校準(zhǔn)不確定度。
　　五、校準(zhǔn)結(jié)果表達
　　校準(zhǔn)結(jié)果應(yīng)包含各項校準(zhǔn)項目的具體數(shù)值和結(jié)論，如分辨力、線性相關(guān)系數(shù)、檢出限、漂移率、重復(fù)性等的具體數(shù)值和是否合格等結(jié)論。
　　六、復(fù)校時間間隔
　　建議不超過一年進行復(fù)校，以確保流式細胞儀的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。
　　七、安全操作與保養(yǎng)
　　在操作流式細胞儀時，需要做好安全防護措施，如佩戴防護眼鏡、手套等。
　　對樣品進行處理前，應(yīng)先進行消毒處理。
　　在進行樣品注入時，應(yīng)進行過濾和細胞計數(shù)，控制加入的細胞數(shù)量。
　　遵守嚴(yán)格的操作規(guī)程，避免將手伸入儀器內(nèi)部或進行不當(dāng)操作。
　　定期對儀器進行內(nèi)部清潔和校準(zhǔn)，更換濾網(wǎng)和試劑等易損件。
　　儀器應(yīng)放置在適宜的環(huán)境下工作，避免過高或過低的溫度和濕度對儀器造成影響。
　　綜上所述，流式細胞儀的校準(zhǔn)規(guī)范涵蓋了多個方面和細節(jié)問題。只有嚴(yán)格按照規(guī)范進行校準(zhǔn)和操作，才能確保流式細胞儀的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，為科研和臨床提供可靠的數(shù)據(jù)支持。

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