流式細胞儀校準規范

機械智探

　　流式細胞儀的校準規范是確保實驗結果準確性的重要步驟，其規范通常涵蓋多個方面，以下是對流式細胞儀校準規范的詳細歸納：
　　一、校準適用范圍
　　基于熒光檢測原理的分析型流式細胞儀的校準應參考相關規范執行，其他類型的流式細胞儀可參照執行。
　　二、校準條件
　　環境溫度：應控制在（15~30）℃。
　　相對濕度：室內相對濕度應≤70%。
　　三、校準設備
　　校準設備需經檢定合格，且應包括以下標準物質和化學試劑：
　　標準物質
　　單一熒光強度的熒光微球標準物質：用于分辨力校準。
　　多重熒光強度混合熒光微球標準物質：用于線性相關系數校準。
　　計數熒光微球標準物質。
　　淋巴細胞計數標準物質：用于重復性+示值誤差校準。校準時應采用有證標準物質，相對擴展不確定度不超過20%（k=2）。
　　化學試劑
　　去離子水：電阻率為18.2MΩ·cm，且需經0.22μm濾膜過濾。
　　磷酸鈉緩沖液：0.1mol/L，pH值控制在7.2~7.4范圍內。
　　移液器：量程為（200~1000）μL，且需達到B級及以上標準。
　　四、校準項目與方法
　　外觀檢查：采用目測、手動法進行檢查。
　　分辨力校準
　　儀器預熱至正常工作狀態。
　　在裝有0.5mL經0.22μm濾膜過濾的磷酸鹽緩沖液的試管中，加入0.5mL單一熒光強度的熒光微球標準物質，混勻后上機實驗。
　　記錄前向角散射光和488nm激發下兩個熒光通道（綠色熒光FITC、橙紅色熒光PE）的信號。
　　收集門內有效信號10000個，計算前向角散射光和兩個熒光通道中校準微球峰寬的相對標準偏差，即為分辨力。
　　線性相關系數校準
　　在裝有1mL經0.22μm濾膜過濾的磷酸鹽緩沖液的試管中，加入20μL多重熒光強度混合熒光微球標準物質，混勻后上機實驗。
　　記錄488nm激發下綠色熒光（FITC）、橙紅色熒光（PE）通道信號。
　　對試驗結果進行直方圖分析，得到每個峰的平均熒光強度。
　　根據校準微球標準物質證書提供的各個峰的等量可溶性熒光分子（MESF），將各峰的MESF取對數lg(MESF)，簡化表示為y；各峰測量的平均熒光強度取對數lg(FITC)或lg(PE)，簡化表示為x。將兩者線性回歸得到方程y=kx+b，計算兩個通道的線性相關系數（r）。
　　檢出限校準
　　針對綠色熒光（FITC）和橙紅色熒光（PE）熒光通道，采用線性相關系數校準中得到的線性回歸方程y=kx+b。
　　計算無熒光標記的空白微球的平均熒光強度值對應的MESF，即為熒光檢出限（LOD）。
　　漂移校準
　　將周圍環境溫度控制在允許范圍內（設定溫度±3℃）。
　　在裝有1mL經0.22μm濾膜過濾的磷酸鹽緩沖液的試管中，加入數滴單色熒光微球標準物質，混勻后上機試驗。
　　記錄前向角散射光和488nm激發下綠色熒光（FITC）、橙紅色熒光（PE）通道的信號，收集10000個以上門內有效信號。
　　測試完成后，利用直方圖分析試驗結果，計算標準微球的平均熒光強度值。
　　連續開機2小時后，在相同流式細胞儀設置和熒光通道電壓值的條件下重復前述試驗步驟，得到新的平均熒光強度值。
　　計算相對漂移率來表示穩定性。
　　重復性校準
　　取100μL淋巴細胞標準物質，按比例添加抗原決定簇CD4抗體，輕柔渦旋充分混勻后避光存放半小時，使CD4抗體與細胞充分結合。
　　標記好CD4抗體后上機測試，收集10000個以上門內有效信號。
　　重復測量6次，依次記錄每次測量的CD4陽性細胞占總淋巴細胞的百分比。
　　計算CD4陽性細胞數量占總淋巴細胞的百分比的相對標準偏差（RSD），作為重復性的評價。
　　示值誤差校準
　　按照重復性校準實驗中得到的CD4陽性細胞占總淋巴細胞的百分比計算平均值。
　　然后計算示值誤差，最后評估示值誤差校準不確定度。
　　五、校準結果表達
　　校準結果應包含各項校準項目的具體數值和結論，如分辨力、線性相關系數、檢出限、漂移率、重復性等的具體數值和是否合格等結論。
　　六、復校時間間隔
　　建議不超過一年進行復校，以確保流式細胞儀的準確性和穩定性。
　　七、安全操作與保養
　　在操作流式細胞儀時，需要做好安全防護措施，如佩戴防護眼鏡、手套等。
　　對樣品進行處理前，應先進行消毒處理。
　　在進行樣品注入時，應進行過濾和細胞計數，控制加入的細胞數量。
　　遵守嚴格的操作規程，避免將手伸入儀器內部或進行不當操作。
　　定期對儀器進行內部清潔和校準，更換濾網和試劑等易損件。
　　儀器應放置在適宜的環境下工作，避免過高或過低的溫度和濕度對儀器造成影響。
　　綜上所述，流式細胞儀的校準規范涵蓋了多個方面和細節問題。只有嚴格按照規范進行校準和操作，才能確保流式細胞儀的準確性和穩定性，為科研和臨床提供可靠的數據支持。

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