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DNA測(cè)序方法是指分析特定DNA片段的堿基序列，即腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）與鳥嘌呤（G）的排列方式的技術(shù)。以下是幾種常見的DNA測(cè)序方法： 一、傳統(tǒng)測(cè)序方法雙脫氧鏈末端終止法（Sanger測(cè)序法） - 由英國生化學(xué)家弗雷德里克·桑格爾發(fā)明，是目前應(yīng)用最廣泛的測(cè)序方法之一。
- 原理是利用DNA聚合酶來延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物，直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測(cè)定由一套四個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)構(gòu)成，每個(gè)反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸（dNTP），并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團(tuán)，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點(diǎn)由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。
- 產(chǎn)生的DNA片段具有共同的起始點(diǎn)，但終止在不同的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，然后用X-光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，從而獲得DNA序列。
化學(xué)降解法 - 由Maxam和Gilbert發(fā)明，與Sanger測(cè)序法在原理上差異很大，但同樣是根據(jù)核苷酸在某一固定的點(diǎn)開始，隨機(jī)在某一個(gè)特定的堿基處終止，產(chǎn)生A、T、C、G四組不同長度的一系列核苷酸。
- 然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進(jìn)行檢測(cè)，從而獲得DNA序列。
二、高通量測(cè)序方法隨著技術(shù)的發(fā)展，高通量測(cè)序方法逐漸興起，這些方法能夠同時(shí)測(cè)定大量的DNA序列，大大提高了測(cè)序效率。 第二代測(cè)序技術(shù) - 以循環(huán)陣列合成測(cè)序法為代表，通過讀取DNA聚合酶或DNA連接酶將堿基連接到DNA鏈上過程中釋放出的光學(xué)信號(hào)來間接確定序列。
- 這種方法需要昂貴的光學(xué)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，并要記錄、存儲(chǔ)并分析大量的光學(xué)圖像，增加了儀器的復(fù)雜性和成本。
第三代測(cè)序技術(shù) - 代表技術(shù)為直接測(cè)序法，將基因組DNA隨機(jī)切割成片段，制成單鏈并與六寡聚核苷酸探針雜交。然后驅(qū)動(dòng)結(jié)合了探針的基因組文庫片段通過可尋址的納米孔陣列，通過每個(gè)孔的離子電流均可獨(dú)立測(cè)量，追蹤電流的變化來確定探針雜交在每個(gè)基因組片段上的精確位置。最后利用基因組片段上雜交探針的重疊區(qū)域?qū)⒒蚪M片段文庫排列起來，建立一組完整的基因組探針。
- 這種方法不需要使用化學(xué)試劑，有望進(jìn)一步降低測(cè)序成本。
三、特定應(yīng)用場景的測(cè)序方法全基因組測(cè)序（WGS） - 把物種細(xì)胞里面完整的基因組序列從第一個(gè)DNA開始一直到最后一個(gè)DNA，完完整整地檢測(cè)出來并排列好。能夠鑒定出基因組上幾乎任何類型的突變。
全外顯子測(cè)序（WES） - 針對(duì)基因組中的外顯子區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，外顯子是基因中編碼蛋白質(zhì)的序列部分。這種方法能夠更高效地篩選出與遺傳疾病相關(guān)的基因突變。
靶向DNA測(cè)序 - 針對(duì)特定的基因或基因組區(qū)域進(jìn)行測(cè)序。這種方法通常用于研究特定的遺傳疾病或基因功能。
單細(xì)胞測(cè)序 - 在單細(xì)胞層面進(jìn)行基因組測(cè)序，能夠揭示細(xì)胞間的異質(zhì)性。這對(duì)于研究發(fā)育生物學(xué)、腫瘤學(xué)等領(lǐng)域具有重要意義。
甲基化測(cè)序 - 針對(duì)DNA甲基化修飾進(jìn)行測(cè)序，甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾方式。甲基化測(cè)序能夠揭示基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制，對(duì)于研究疾病的發(fā)生和發(fā)展具有重要意義。常見的甲基化測(cè)序技術(shù)包括全基因組DNA甲基化測(cè)序（WGBS）、簡化基因組甲基化測(cè)序（RRBS）等。
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發(fā)表于 2024-10-31 09:37:05
